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外泌體（Exosomes）是由內(nèi)體衍生的小型脂質(zhì)納米顆粒，直徑約 30-200 納米，大多數(shù)活細(xì)胞會(huì)通過胞吐作用主動(dòng)分泌外泌體?[1]。無論是在病理還是生理狀態(tài)下，外泌體的釋放既可以是持續(xù)性的，也可以是誘導(dǎo)性的，且釋放過程具有動(dòng)態(tài)性、可控性和功能相關(guān)性。外泌體的分子組成與釋放量取決于其來源細(xì)胞的狀態(tài)。外泌體可從多種細(xì)胞系、原代培養(yǎng)物中分離獲得，也可從血清、血漿、唾液等生物體液中提取。鑒于來源的多樣性，外泌體具有多效的生理功能，且越來越多的研究表明，其在癌癥、感染性疾病、神經(jīng)退行性疾病等多種病理狀態(tài)中發(fā)揮著重要作用。因此，外泌體成為液體活檢方法中的關(guān)鍵研究對(duì)象?[2]。此外，外泌體還可通過工程改造，成為具有潛力的藥物遞送載體?[3]。
由于外泌體體積微小，從復(fù)雜的生物基質(zhì)中分離外泌體頗具挑戰(zhàn)性，且分離產(chǎn)量通常較低。在此背景下，Simple Western™成為研究外泌體的理想技術(shù)：該方法僅需 3 微升樣品，且具備皮克級(jí)靈敏度，大幅減少了傳統(tǒng)Western blot對(duì)所需外泌體量的要求。隨后，可使用針對(duì)外泌體相關(guān)抗原的特異性檢測抗體對(duì)之進(jìn)行表征分析 —— 這些目標(biāo)抗原既可以是外泌體的通用標(biāo)志物，也可以是其來源細(xì)胞或體液所有的標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)方案中，我們將利用市售的外泌體標(biāo)準(zhǔn)品和抗體，通過Simple Western™檢測外泌體的通用標(biāo)志物和來源特異性標(biāo)志物。
本篇文章介紹以“人血漿、人血清、人A549細(xì)胞（肺泡基底上皮腺癌細(xì)胞）"三種外泌體標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)象，驗(yàn)證下表中抗體的有效性的結(jié)果：
01. 通用外泌體標(biāo)志物的表達(dá)
• Flotillin-1：作為經(jīng)典通用標(biāo)志物，在三種標(biāo)準(zhǔn)品中均檢測到（圖1A）。
• Alix：在三種標(biāo)準(zhǔn)品中均有表達(dá)，但A549細(xì)胞來源外泌體中表達(dá)量更高（圖1D）。
02. 來源特異性標(biāo)志物的表達(dá)
• Annexin V：作為凋亡標(biāo)志物與血液抗凝蛋白，在A549細(xì)胞、血漿來源外泌體中檢測到，在血清來源外泌體中未檢測到（圖1B）。
• EGFR（HER1）：僅在A549細(xì)胞來源外泌體中檢測到，血清、血漿來源外泌體中無信號(hào)（圖1C）。
圖 1 利用Simple Western™測外泌體目標(biāo)抗原。A：flotillin-1；B：Annexin V；C：EGFR；D：Alix。
03. 特殊處理需求的標(biāo)志物
• CD63：僅當(dāng)用PNGase F（去糖基化酶）處理外泌體標(biāo)準(zhǔn)品后，才可檢測到信號(hào)，提示糖基化修飾對(duì)該標(biāo)志物檢測的影響（圖2）。
04. 其他標(biāo)志物驗(yàn)證
表2中其余抗體（如Annexin A2、HSPA8/HSC70、TSG101等）均通過Simple Western驗(yàn)證，可在對(duì)應(yīng)外泌體標(biāo)準(zhǔn)品中檢測到目標(biāo)信號(hào)（圖2）。
圖2. 在血漿和 A549 細(xì)胞來源的外泌體標(biāo)準(zhǔn)品中，各目標(biāo)抗原的檢測泳道視圖。
—— Simple Western技術(shù)核心價(jià)值 ——
(1) 微量高效：僅需3-5μL外泌體裂解液（傳統(tǒng)WB需50μL+），適配珍貴樣本；毛細(xì)管全流程減少樣本損耗，適合低豐度膜蛋白。
(2) 高靈敏度：皮克級(jí)檢測下限，可測CD63/Alix等，經(jīng)PNGase F處理破解糖基化干擾，實(shí)現(xiàn)EGFR等特異性檢測。
(3) 抗基質(zhì)干擾：12-230kDa毛細(xì)管電泳去雜，外泌體裂解后可直接上機(jī)，無需繁瑣純化。
(4) 多重定量：單樣本同步測8個(gè)靶點(diǎn)，符合MISEV標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)態(tài)范圍覆蓋6個(gè)數(shù)量級(jí)。
(5) 自動(dòng)化流程：3小時(shí)全自動(dòng)化出結(jié)果，減少蛋白降解；每孔獨(dú)立質(zhì)控，滿足外泌體制備QC。
(6) 精準(zhǔn)定量：支持絕對(duì)/相對(duì)定量，低樣本量+高重復(fù)性，適配液體活檢標(biāo)志物開發(fā)，加速科研到臨床轉(zhuǎn)化。
* 本文轉(zhuǎn)載自「ProteinSimple」微信公眾號(hào)
* 參考文獻(xiàn):
1. Exosomes, D M Pegtel and S J Gould, Annual Review of Biochemistry, 2019, 88:487–514.
2. Extracellular vesicles – biomarkers and effectors of the cellular interactome in cancer, J Rak, Frontiers in Pharmacology, 2013, 4:21.
3. Exosomes as reconfigurable therapeutic systems, R Conlan, S Pisano, M Oliveira, M Ferrari and I Mendes Pinto, Trends in Molecular Medicine, 2017, 23(7):636–650.
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ProteinSimple 是美國納斯達(dá)克上市公司Bio-Techne集團(tuán) (NASDAQ:TECH) 旗下的蛋白質(zhì)分析品牌。“使蛋白質(zhì)分析更簡單"是ProteinSimple 一直以來的愿景。ProteinSimple長期致力于研發(fā)和生產(chǎn)更精準(zhǔn)、更快速、更靈敏的創(chuàng)新性蛋白質(zhì)分析工具，包括蛋白質(zhì)電荷表征、蛋白質(zhì)純度分析、蛋白質(zhì)翻譯后修飾定量檢測、蛋白質(zhì)免疫檢測技術(shù)如數(shù)字Western Blot和高靈敏微流控多重ELISA，以幫助生物制藥、細(xì)胞與基因治療、生物醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)等領(lǐng)域科學(xué)家解決蛋白質(zhì)分析問題，加速藥物研發(fā)效率，深度解析蛋白質(zhì)和疾病的關(guān)系。作為ProteinSimple華東大區(qū) (江、浙、滬、皖、山東) 的授權(quán)代理商，上海昊擴(kuò)將為大家提供ProteinSimple旗下儀器設(shè)備。
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